Firewall против COVID

Налили в резервуар устройства 1 литр стерильной деионизированной воды. Включили прибор, налили через прибор 0,75 литра. Собранную воду слили, резервуар опорожнили. Этот шаг необходим для удаления воздуха из системыи заполнения внутреннего резервуара.

Добавили 1 мл исходного раствора вируса, содержащего приблизительно 1,0 × 108 TCID50 SARS-CoV-2, Isolate USA-WA1 / 2020 (BEI Resources NR-52281), в 1-литровую бутылку стерильной дехлорированной водопроводной воды и тщательно перемешали.

Поместили весь литр в резервуар устройства.

Отобрали три 30-миллилитровых образца из резервуарав стерильные конические пробирки (образцы Influent A, B и C).

Вылили 0,5 литра в ведро для отходов(чтобы промыть внутренний 0,39-литровый резервуар и убедиться, что вода с вирусом разливается для теста).

Разлили три образца сточных вод по 30 мл каждый в стерильные конические пробирки объемом 50 мл (образцы сточных вод A, B и C).

Засеяли внутреннюю часть носика крана дозатора стерильным полиэфирным тампоном, погруженным в вирусный запас, содержащий 6,3 × 106 TCID50 / мл SARS-CoV-2. Протёрли тампоном изнутри наконечника крана. Это включало в себя введение тампона внутрь до упора и его скручивание назад и вперёд. (Головка корпуса Firewall спроектирована и имеет такой контур, что некоторое количество ультрафиолета вытесняет воду из крана дозатора.На расстоянии ½ дюйма за пределами патрубка крана доза ультрафиолета измеряется на уровне 12 мкВт-сек/см2).

Из устройства налили 10 мл воды(чтобы в носик крана мог попадать УФ-свет).

Окунули стерильный полиэфирный тампон в 5-миллилитровую пробирку с защёлкивающимся колпачком, содержащую 1 мл стерильного PBS, и использовали его для протирки внутренней части носика крана. Поместили тампон обратно в пробирку и отломили лишнюю деревянную ручку, чтобы тампон оказался внутри пробирки.

Перемешали эту пробирку на вортексе в течение 30 секунд, чтобы элюировать вирус из тампона, а затем асептически удалилии выбросили тампон (этот раствор представлял собой образец «насадки»).

Концентрации вируса для каждого нейтрализованного образца были количественно определены с использованием метода Рида-Мюнча (Paymentand Trudel, 1993), чтобы определить инфекционную дозу культуры ткани, которая затронула 50% лунок (TCID50). Анализ выполняли в 96-луночных планшетах для культивирования клеток, содержащих монослои клеток Vero E-6 (ATCC # CRL-1586). Перед анализом клетки Vero E-6 дважды осторожно промывали минимальной необходимой средой (MEM). Затем 96-луночные планшеты инокулировали разбавленными образцами (6 лунок инокулировали по 100 микролитров в каждой на разведение). Колбы, содержащие 1 мл (в колбах 25 см2) и 10 мл (в колбах 75 см2), также были включены для снижения предела обнаружения анализа. Планшеты / колбы инкубировали в атмосфере 5% CO2 в течение1 часа при 37 °C, чтобы вирусные частицы могли адсорбироваться на клетках.

Примечание: Каждый 96-луночный планшет также включалпо крайней мере 6 лунок с отрицательным контролем, содержащих только клетки (без вируса) с добавленными 100 микролитрами MEM

После этого инкубационного периода в каждую из 96 лунок добавляли 85 микролитров MEM, содержащей 2% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), во флаконы на 25 см2 добавляли 7 мл,а во флаконы на 75 см2 добавляли 20 мл. Затем планшеты / колбы инкубировали в атмосфере 5% CO2 в течение 7 дней при 37 °C.

Клетки ежедневно наблюдали на предмет вирусных цитопатических эффектов (ЦПЭ) с помощью инвертированного микроскопа. Инокулированные клетки сравнивали с клетками отрицательного контроля в том же 96-луночном планшете, чтобы дифференцировать ЦПЭ от неинокулированных клеток. В анализ также были включены колбы с отрицательным контролем. Любой CPE, который наблюдался в течение 24 часов после инкубации, считался вызванным цитотоксичностью (вызванной чувствительностью клетокк водопроводной воде), поскольку CPE, вызванный SARS-CoV-2, обычно требует ≥ 2 дней. Лунки с положительным результатом на CPE через 2 дня считались положительными на рост вируса.

Примечание: CPE не наблюдалось ни в одной из лунокс отрицательным контролем.

После инкубационного периода определяли TCID50 / образец.Для обеспечения адекватной точности анализа использовали шесть лунок на разведение. Наибольшее разведение, при котором 50% или выше лунок были положительными, использовали для определения TCID50 вируса / купон в соответствии с методом, описанным Paymentand Trudel (1993).

Данные были представлены в виде логарифмического сокращенияс использованием формулы -log₁₀ (Neff/ Ninf), где Ninf была средней концентрацией восстановленного SARS-CoV-2 из поступающих образцов, а Neffбыла концентрацией восстановленного SARS-CoV-2. в пробах стоков.

T-критерий Стьюдента использовался для статистического сравнения вируса, выделенного из притока (без УФ) и сточных вод. Снижение считалось статистически значимым, если результирующее значение P было ≤ 0,05.

Также был рассчитан средний процент снижения.